第770章 770.变异
令人信服的证据支持炎症成分参与癌症发展的不同阶段，包括癌变、癌症侵袭和转移。然而，在流行病学和实验研究中，以嗜酸性粒细胞显着浸润到炎症部位为特征的过敏原诱导的气道炎症与癌症风险呈负相关。嗜酸性粒细胞浸润在临床的各种实体瘤中也经常观察到，并且在大多数研究中通常与良好的预后相关，表明嗜酸性粒细胞具有潜在的抗肿瘤作用。这引发了大量研究，以解决所涉及的潜在机制。几项研究已经证明了体内和体外嗜酸性粒细胞的抗肿瘤功能并强调了各种机制，概括为(i)细胞毒性颗粒和酶的脱颗粒以直接杀死肿瘤细胞，以及(ii)产生广泛的免疫活性因子来调节肿瘤环境。然而，关于嗜酸性粒细胞对肿瘤转移的直接影响的信息很少。
肿瘤微环境中的嗜酸性炎症也可能导致转移。嗜酸性粒细胞相关细胞因子，如白细胞介素-5(IL-5)，是影响过敏性炎症中嗜酸性粒细胞分化和存活的关键因素。虽然混杂因素使嗜酸性炎症和肿瘤之间的关系复杂化，但已有文献表明IL-5通过嗜酸性粒细胞形成肺的转移性定植。据报道，嗜酸性过氧化物酶(EPX)在4T1乳腺癌模型中促进肿瘤转移。通过组织染色，EPX也被认为是预测原发性肺腺癌患者临床结局的潜在生物标志物。这些研究表明，嗜酸性粒细胞及其介质在癌症转移中的作用可能比之前所了解的要大得多。因此，应该重新考虑嗜酸性粒细胞的抗肿瘤作用，直到有更多的证据说明嗜酸性粒细胞在癌症转移中的作用机制。
以前报道，C-C趋化因子配体6(CCL6)是一种主要由单核细胞或巨噬细胞中产生的趋化因子，过度表达CCL6可以加速肿瘤生长，并增加小鼠肿瘤局部和转移扩散。CCL6与人C-C趋化因子MPIF-1CCL23具有同源性，MPIF-1CCL23在肿瘤组织中显著上调。CCL23的高表达与癌症患者的加速进展和短生存期相关。前期研究表明CCL6CCL23结合并激活C-C趋化因子受体1(CCR1)，表达于多种免疫细胞和肿瘤细胞表面，促进肿瘤转移。在这里，我们假设CCL6-CCR1信号通路参与了嗜酸性粒细胞相关的肿瘤转移。因此，我们研究了嗜酸性粒细胞在炎症作用下对实验性肿瘤细胞转移的作用，发现嗜酸性粒细胞促进了CCL6依赖的转移性肿瘤的生长。
研究结果
1.卵清蛋白诱导的气道炎症和葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎症促进小鼠转移
为了确定伴有嗜酸性粒细胞增多的炎症对肿瘤转移的影响，我们首先在我们首先建立了C57BL6野生型(WT)小鼠典型卵清蛋白(OVA)诱导哮喘模型后的黑色素瘤肺转移模型。我们观察到与对照小鼠相比，气道炎症小鼠的肺转移显着增。
然后建立实验性葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎模型，然后将肿瘤细胞注射到腹腔中。此外，DSS诱导的结肠炎症导致结肠转移的加重表型。
随后探索缓解炎症以防止转移的作用。广谱抗炎药地塞米松(DEX)可有效抑制气道炎症以减少肺转移。
为了确认嗜酸性粒细胞增多，我们对OVA模型中的肺组织和DSS模型中的结肠进行了免疫组织化学和流式细胞术分析。结果确定了气道炎症中的嗜酸性粒细胞浸润。
DSS诱导的结肠炎表现为结肠黏膜中大量白细胞浸润，包括嗜酸性粒细胞。
嗜酸性粒细胞缺乏小鼠减弱了OVA刺激后的肺转移，而在DSS治疗后它们对结肠转移没有影响。这与嗜酸性粒细胞缺乏消除OVA诱导的气道炎症但未能缓解DSS诱导的结肠炎的证据一致
2.嗜酸性粒细胞增多对于Cd3δ-Il-5转基因小鼠骨转移增加是必不可少的
接下来，为了研究持续性嗜酸性粒细胞增多对体内转移的长期影响，我们利用了Cd3δ-Il-5转基因(Il-5Tg)小鼠，如图2A所示骨髓中产生了非常高水平的嗜酸性粒细胞，并维持在外周血中。通过尾动脉注射肿瘤细胞将肿瘤细胞输送到髂总动脉下游的器官，主要在下脊柱和后肢中高频发生骨转移。与WT小鼠中较少的脊柱转移相反，我们在Il-5Tg小鼠中观察到更多可见的色素性脊柱病变。
据报道，肿瘤细胞的尾静脉注射很少导致骨转移。然而，除了更多的脊柱转移数量外，Il-5Tg小鼠的转移风险显着更高。在胫骨和股骨中也证实了类似的结果。股骨的组织学检查显示Il-5Tg小鼠的早期定植和明显的肿瘤病灶。
鉴于IL-5已被证明通过调节多种宿主细胞来支持转移，包括嗜酸性粒细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，我们接下来确定了骨转移增加和嗜酸性粒细胞的联系。为此，我们将Il-5Tg小鼠与Eos-null小鼠交叉以消除嗜酸性粒细胞。然后，我们用WT、Il-5Tg、Il-5Tg和Eos-null小鼠的BM重建辐照WT小鼠，以排除BM基质细胞对骨转移的贡献。注射肿瘤细胞后，接受来自Il-5Tg和Eos-null供体的BM的嵌合小鼠没有表现出转移数量和肿瘤负荷的增加。这些结果证实嗜酸性粒细胞增多对于增加Il-5Tg小鼠的骨转移是必不可少的。
3.嗜酸性粒细胞直接支持肿瘤细胞迁移和转移形成
鉴于观察到Il-5Tg小鼠早期骨转移增强，我们研究了嗜酸性粒细胞是否能直接促进肿瘤细胞的生存和生长。我们研究了嗜酸性粒细胞是否可以直接促进肿瘤细胞的存活和生长。通过进行体外实验，在不存在嗜酸性粒细或存在嗜酸性粒细胞的情况下培养肿瘤细胞，我们发现肿瘤细胞的克隆活性没有明显改变。考虑到嗜酸性粒细胞可能会诱导肿瘤细胞凋亡和坏死，我们评估了与嗜酸性粒细胞共培养的肿瘤细胞的存活率。没有发现嗜酸性粒细胞对肿瘤细胞死亡的显着影响。类似的发现表明，有或没有嗜酸性粒细胞，EdU阳性增殖肿瘤细胞的比例没有明显差异，肿瘤细胞的细胞周期也没有变化。这些结果表明嗜酸性粒细胞对改变肿瘤细胞生长没有实质性影响。
随后，我们在体外进行了迁移实验。在培养过程中，与嗜酸性粒细胞直接或间接接触后，肿瘤细胞的迁移能力显著增强，提示嗜酸性粒细胞以接触无关的方式促进肿瘤细胞的迁移。用来从Il-5Tg小鼠和对照小鼠的BM上清液进行迁移试验，研究结果表明，嗜酸性粒细胞来源的因子可能促进肿瘤细胞迁移。
我们将肿瘤细胞与嗜酸性粒细胞混合，然后将混合物静脉内共注射到WT小鼠中，与单独注射肿瘤细胞相比，这导致肺转移增加。在平行实验中，嗜酸性粒细胞在肿瘤细胞静脉注射后立即被过继转移（气管内），这导致了类似的结果。
接下来我们研究了嗜酸性粒细胞与癌症患者转移之间的关系。与非癌症患者的胸腔积液相比，胸膜转移患者的恶性胸腔积液(MPE)检测到更多的嗜酸性粒细胞(图4，A和B)，其他免疫细胞包括巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞没有变化。
4.CCL6在嗜酸性粒细胞诱导的肿瘤细胞迁移和嗜酸性粒细胞依赖的转移形成中至关重要
我们的目的是确定嗜酸性粒细胞促进肿瘤细胞迁移和转移形成的有效因素。既往研究报道CCL2、CCL3、CCL5、CCL6、CCL8、CXCL12、CXCL14等细胞因子和趋化因子直接或间接靶向肿瘤细胞促进转移。我们采用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)从Il-5Tg小鼠和WT小鼠的BM细胞中筛选一组细胞因子和趋化因子。CCL6是Il-5Tg小鼠中最丰富的细胞因。由于CCL23已被确定为小鼠CCL6的人类同源基因，我们随后评估了人类样本中的CCL23水平，并发现相对于非癌症患者的胸腔积液，MPE中CCL23浓度增加(图4D)。此外，CCL6的高分泌主要在嗜酸性粒细胞中发现(图4E)。为了确定嗜酸性粒细胞衍生的CCL6是否参与肿瘤细胞迁移和转移，我们产生了Ccl6敲除小鼠（Ccl6）并将它们与Il-5Tg小鼠（Il-5Tg和Ccl6）杂交。相对于Il-5Tg小鼠，Il-5Tg和Ccl6小鼠的嗜酸性粒细胞的基础数量没有差异。分离来自Il-5Tg小鼠的Eos和来自Il-5Tg和Ccl6小鼠的EosCcl6两种类型的嗜酸性粒细胞以进行体外迁移测定，值得注意的是，向EosCcl6迁移的肿瘤细胞的数量减少了。
嗜酸性粒细胞或CCL6缺失不影响体内基线肺转移(图S10，C和D)，而嗜酸性粒细胞CCL6缺失显著减少嗜酸性粒细胞依赖性肺转移。与Il-5Tg小鼠相比，Il-5Tg和Ccl6小鼠通过尾动脉注射肿瘤细胞后骨转移也少得多。此外，静脉注射肿瘤细胞后，在CCL6缺乏的Il-5Tg小鼠中，骨转移数的增加和肿瘤负荷均有所降低。总之，这些观察结果表明CCL6在体内对嗜酸性粒细胞诱导的肿瘤细胞迁移和嗜酸性粒细胞依赖的转移形成至关重要。
5.抑制CCL6受体CCR1可减轻肿瘤细胞迁移和转移的形成
据报道，CCR1是一种推定的CCL6受体。我们探讨了嗜酸性粒细胞衍生的CCL6是否可以通过CCR1将肿瘤细胞募集到转移部位。我们通过shRNA稳定敲除B16-F10细胞中的CCR1，慢病毒非靶向shRNA作为对照。CCR1缺陷的B16-F10（shCCR1B16-F10）细胞向嗜酸性粒细胞或嗜酸性粒细胞培养上清液的迁移显着减少。CCR1缺陷的B16-F10细胞在Il-5Tg小鼠中也显示出较少的骨转移，在OVA攻击的小鼠中显示出较少的肺转移。这些结果证明，CCR1在肿瘤细胞中的表达对于嗜酸性粒细胞诱导的肿瘤细胞迁移和转移形成至关重要。
我们通过使用CCR1特异性抑制剂BX471进一步检测了CCR1抑制对肿瘤细胞的影响。BX471显着减弱了体外嗜酸性粒细胞上清液诱导的B16-F10细胞的迁移。BX471处理的肿瘤细胞在体内发生的骨转移明显减少。由于嗜酸性粒细胞中的CCL6缺失或CCR1在肿瘤细胞中的抑制足以缓解嗜酸性粒细胞诱导的肿瘤细胞迁移和转移形成，因此CCL6-CCR1信号传导可能是预防嗜酸性粒细胞依赖性肿瘤转移的有价值的治疗策略。
研究结论
证据表明炎症成分有助于癌症的发展。然而，涉及几种炎症性疾病的嗜酸性粒细胞在癌症转移中并未得到充分探索。我们发现气道炎性嗜酸性粒细胞增多和伴有嗜酸性粒细胞浸润的结肠炎症都与小鼠转移增加有关。嗜酸性粒细胞增多是富含嗜酸性粒细胞的Cd3-Il-5转基因(Il-5Tg)小鼠骨转移增加的原因。我们还观察到有胸膜转移的癌症患者的恶性胸腔积液中嗜酸性粒细胞增多。从机制上讲，嗜酸性粒细胞通过分泌CCL6促进肿瘤细胞迁移和转移形成。在Il-5Tg小鼠中Ccl6的基因敲除显着减弱了骨转移。此外，抑制肿瘤细胞中的CCR1（CCL6的受体）可减少肿瘤细胞的迁移和转移。因此，我们的研究确定了嗜酸性粒细胞的CCL6依赖性促转移活性，它可以通过靶向CCR1来抑制，并代表了一种预防转移性疾病的方法。在目前的研究结果和上述讨论的基础上，应更加关注评估癌症患者转移相关的组织嗜酸性粒细胞增多。在这里，我们预测通过嗜酸性粒细胞浸润直接靶向炎症或阻断嗜酸性粒细胞相关趋化因子途径可以在癌症患者中获得临床益处。我们也呼吁警惕肿瘤患者嗜酸性粒细胞增多引起的转移风险和不良预后。我们已经确定了以前未知的嗜酸性粒细胞在支持肿瘤细胞募集方面的CCL6依赖性促转移活性，它可以被CCR1抑制剂靶向，并且可能代表一种预防转移性疾病的方法。
研究优点
应用多种小鼠模型及人类样本进行相互验证，实验设计严谨，工作量较大。
借鉴：尾静脉注射以后可改为尾动脉注射，更易促转移。
研究缺点
静脉或气管注入肿瘤细胞后，检测胸腔积液中其他类型免疫细胞没有变化，进一步实验分析转移肿瘤内各免疫细胞的变化是否有差异。
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